Набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах

НАЗНАЧЕНИЕ

 РАS- реакция является важным методом для идентификации прежде всего лимфацитарных клеточных элементов. Вместе с реакцией на миелопероксидазу и неспецифическую эстеразу, РАS- реакция является одним из основных цитохимических методов для дифференциальной диагностики острых лейкозов.

 РЕАГЕННТЫ

 Набор обеспечивает 6 исследований (от1 до 10 препаратов) .

 Вошедшие  в набор:

 Йодная кислота;

 Реактив Шиффа.

 Гематоксилин Майера.

Не вошедшие в набор:

 1. Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина)

 Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина):

 1мл 40% формалина смешивают с 9 мл 96° этилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригоден. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.

 2.   Дистиллированная вода.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕГО РАСТВОРА

 Содержимое флакона с йодной кислотой растворить в 50мл дистиллированной воды  (получаем 1% раствор йодной кислоты). Раствор сохраняет свои свойства в течение 3 месяцев в темном месте.

ПРИНЦИП РЕАКЦИИ

 Механизм РАS- реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп, или их амино- или алкиламино- производных до альдегидов. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета.

ХОД РЕАКЦИИ

1. Сухие мазки крови или к /мозга фиксировать в 10% спирт - формалиновой смеси - 10мин.

2. Промыть проточной водой  - 10сек.

3. Поместить мазки в1 % раствор йодной кислоты  - 10мин.

4. Промыть дистиллированной водой и промокнуть фильтровальной  бумагой - 10сек.

5.   Поместить мазки в реактив Шиффа  - 30 мин  ( с помощью пинцета, осторожно! Реактив слить назад, не загрязнять!) реактив Шиффа хранится в бутылке из темного стекла, плотно закрытой, при температуре 4ºС. За полчаса до употребления  - вынуть из холодильника.

6.   Промыть стекла в проточной воде -  5мин.

7.   Докрасить мазки гематоксилином  Майера  - 15мин.

8.   Промыть в проточной воде - 10сек.

Примечание:

  Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.

Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.

При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.

Приготовленные мазки не рекомендуется хранить более суток, т. к. активность большинства внутриклеточных ферментов снижается .

Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе.

Окраску рекомендуется производитьв емкости для окраски мазков ( хим. стакан, емкости Хеллендахела, емкости Коплина).

РЕЗУЛЬТАТЫ ОКРАСКИ

Нормальные цитохимические показатели содержания гликогена в лейкоцитах:

    Для нейтрофилов-95-100% при К = 2,09-2,99.

    Для лимфоцитов от 2 до 33% при К = 0,02-0,52.

Гранулы гликогена окрашиваются в красный или вишнево- красный цвет. Ядра лейкоцитов синие или фиолетовые.

В норме гликоген обнаруживается на стадии миелобласта и его содержание в клетках увеличивается по мере их созревания, достигая максимума в палочко- и сегментоядерных нейтрофилах. Гликоген выявляется также в базофилах, эозинофилах, моноцитах, тромбоцитах, и мегакариоцитах. 5- 30% нормальных лимфоцитов содержат гликоген в виде мелких гранул без диффузного фона.

Изменения при патологических состояниях

   При диагностике острых миело- и монобластных  лейкозов, бластные элементы чаще всего ШИК-отрицательны, или обнаруживают слабодиффузное окрашивание цитоплазмы, иногда с наличием мелких гранул.

    В тоже время лимфобласты при ОЛЛ содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне.