телефон:   E-mail:

(812) 611-30-09

 

info@analitlab.ru

E-mail: info@analitlab.ru

телефон: (812) 611-30-09

Rambler's Top100  

Набор реагентов для цитохимического определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах

НАЗНАЧЕНИЕ

  Определение активности (индекса) щелочной фосфатазы применяется для цитохимической дифференциации хронической миелоидной лейкемии от других заболеваний миелопролиферативного типа.

РЕАГЕНТЫ

Набор обеспечивает 6 исследований

В наборе:

1. Альфа-нафтилфосфат натрия - 6фл

2. Прочный синий РР (диазониевая соль 4-бензоил-2,5-метоксианилина) - 6фл

3. 0,2 М  пропандиоловый буфер - 1 фл (60мл)

4. Метиловый зеленый (сухой краситель)  - 1фл                         

Не вошедшие в набор:

1.  Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина)

Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина):

10мл 40% формалина смешивают с 90 мл метилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригодны. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.

2.   Дистиллированная вода

3.    Соляная кислота (конц.,11М, ρ=1,18г/см³)

Приготовление 0,1н соляной кислоты:

8,33 мл соляной кислоты (конц.) поместить в колбу ( вместимостью 1000 мл) и довести до 1000 мл дистиллированной водой, перемешать.

4.    Хлороформ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ

Приготовление 0,05 М буферного раствора

К содержимому флакона маточного раствора пропандиолового буфера добавить 70мл дистиллированной воды  (проверить рН 9,6 - 9,7), при необходимости  добавить 3,5 мл 0,1н соляной кислоты. Хранить в холодильнике.

Приготовление 2% раствора метилового зеленого

Содержимое флакона метилового зеленого растворить в 100 мл дистиллированной воды и вылить в делительную воронку. В ту же воронку залить 50 мл хлороформа. Смесь взболтать несколько раз в течение дня и оставить на ночь для экстрагирования метилового фиолетового. Краска «метиловый зеленый нестойка, под влиянием света и кислорода воздуха часть метилового зеленого превращается в метиловый фиолетовый, который должен быть экстрагирован хлороформом и удален.

Рабочий раствор

Содержимое флакона с альфа-нафтилфосфатом натрия растворить в 5мл 0,05М буферного раствора и добавить содержимое флакона прочного синего РР. Хорошо перемешать. Готовится перед употреблением и фильтруется прямо на стекла. Рабочий раствор стабилен в течение 15 минут. Раствор имеет красно-коричневый цвет и быстро становится мутным, но мутность не влияет на окраску. 

ПРИНЦИП РЕАКЦИИ

  В основе лежит метод азосочетания - расщепление щелочной фосфатазой  альфа-нафтилфосфата с освобождением альфа-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.

ХОД РЕАКЦИИ

1. Погружение высушенных на воздухе мазков крови или костного мозга на 30 сек в фиксирующий раствор -10% спиртовой раствор формальдегида (из холодильника!).      

2.  Промывание мазков проточной водой в течение 10 сек.

3. Инкубация в субстратной смеси 10 мин при комнатной температуре. Промывание проточной водой 10 мин.

4.  Докраска 2% раствором метилового зеленого в течение 15 мин.

Примечание

Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.

Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.

При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.

 Использовать только хорошо высушенные препараты!

Зафиксированные мазки могут храниться в темноте, при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОКРАСКИ

   Коричневый продукт реакции проявляется лишь в финальных стадиях созревания гранулоцитов. Оценивается 100 нейтрофилов с сегментоядерным ядром. В случае нейтропении учитывается  самое большее 10%  палочкоядерных нейтрофилов. Подсчет соответствия степени окраски учитывает следующие 5 степеней активности цвета:

0 -  степень: реакция отсутствует;

1 - степень: гомогенное бледнокоричневое окрашивание;

2 -  степень: преципитат в виде гранул;

3 -  степень: сильная темно-коричневая окраска;

4 -   степень: максимально чернеющая, по всей цитоплазме, ядра часто не видны.

Нормальные показатели (по Лецкому В.Б.)- 50%, индекс 0,67. 

  Сниженный индекс характерен для активной фазы ХМЛ. Лишь гемолитическая и железодефицитная анемии или некоторые вирусные заболевания показывают сравнительно низкий индекс. Нормальные и повышенные цифры требуют идентификации. ХМЛ в ремиссии может продуцировать нормальную или даже повышенную ЩФ.

 

Создать сайт в Мегагрупп.ру